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夾心法ELISA檢測白介素8的實驗方法

點擊次數(shù)：13149 發(fā)布時間：2016/11/21 9:07:18

Il-8是一種分子量為8～10kD的多肽，對嗜中性粒細胞，T淋巴細胞、嗜鹼性粒細胞具有趨化作用，并可激活嗜中性粒細胞，是一種重要的炎癥介質(zhì)。在嚴重感染病人的血清中、炎癥局部滲出液中都可檢測到高水平的IL-8。此外，近年來的研究表明，IL-8可能與各種組織缺血后再灌注損傷的發(fā)生有關(guān)。我們采用兩株自制的單克隆抗體建立了夾心法ELISA用于檢測IL-8，敏感性可達156Pg/ml，操作簡單，重復(fù)性良好，可用于IL-8的基礎(chǔ)和臨床研究。

一、原理
采用兩株識別不同表位的抗IL-8單克隆抗體，其中一株(4D7)作為包被抗體，以識別和結(jié)合待檢標本中的IL-8,另一株作為酶標抗體，與結(jié)合于包被抗體的IL-8的另一個表位結(jié)合并催化底物顯色。

二、試劑器材

1. 試劑盒提供包被抗體、酶標抗體、標準品，底物(ABTS)、96孔elisa板。

2. 包被緩沖液、PBS、底物緩沖液配制同常規(guī)ELISA法。

三、操作步驟

1. 包被：pH9.5 碳酸鹽緩液稀釋4D7單克隆抗體粗提γ球蛋白至1μg/ml,加入96孔板,100μl/孔，放4℃,36小時。

2. 封閉：0.1%吐溫PBS(Buffer A)沖洗96孔板三次，加3%BSA Buffer A(Buffer B)200μl/孔，放37℃,1小時。

3. 加待檢樣品：Buffer A 沖洗96孔板三次，加待檢樣品及Buffer B 稀釋的標準品100μl/孔，放37℃,3小時。

4. 加酶標抗體：Buffer A沖洗96孔板五次,3%PEG Buffer A稀釋酶標抗體至1∶800，加入96孔板，100μl/孔，放37℃,1小時。

5. 顯色：Buffer A沖洗96孔板五次，pH5.4檸檬酸緩沖液溶解底物(ABTS),0.2mg/ml,加3%H2O2,2μl/ml，加入96孔板，100μ/孔，室溫下或37℃顯色。

四、注意事項

1. 待檢標本如為血清，應(yīng)采用一次性容器，血液采集后盡快(6小時以內(nèi))分離血清。