由于 ELISA（酶聯(lián)免疫試驗(yàn)）具有靈敏度較高、特異性好的特點(diǎn)，現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛的使用，上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司作為一家專業(yè)代理
、對(duì)照品、培養(yǎng)基、細(xì)胞公司。必須對(duì)影響ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果各種因素要有一定的認(rèn)知。優(yōu)質(zhì)的試劑，良好的
和正確的操作是保證ELISA檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件。如不注意，就易出現(xiàn)白板、花板、色弱和假陽(yáng)性等現(xiàn)象。現(xiàn)在我們就將ELISA實(shí)驗(yàn)操作中的注意事項(xiàng)列舉出來(lái)，請(qǐng)收好哦！
1.嚴(yán)重溶血，以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中，殘留在孔內(nèi)的血紅蛋白具有過(guò)氧化物酶樣活性，催化底物顯色造成假陽(yáng)性；混有紅細(xì)胞的血清易沉淀或附著在聚乙烯孔內(nèi)不易洗凈；如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)；標(biāo)本凝疑固不全，有時(shí)為了爭(zhēng)取時(shí)間快速檢測(cè)，常在血液還未開(kāi)始凝固時(shí)即強(qiáng)行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋臼原，在ELSA測(cè)定過(guò)程中可以形成肉眼可見(jiàn)的纖維蛋白塊，易造成假陽(yáng)性結(jié)果；采血試管冼滌不徹底、反復(fù)使用易交叉污染；塑料試管能嘬阼抗原物質(zhì)，樣本久置在塑料管內(nèi)會(huì)使樣本內(nèi)抗原含量下降造成假陰性。
2.血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測(cè)，嚴(yán)重溶血標(biāo)本禁用。一般說(shuō)來(lái)，在5天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可放置于4℃，標(biāo)，在冰箱中保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致血清lgG聚合，使間接法的試劑本底加深超過(guò)一周測(cè)定的需-20℃保存。凍結(jié)血清融解后，蛋臼質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勹并避免產(chǎn)生氣泡。混濁或有沉淀的血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過(guò)濾，澄凊后再檢測(cè)。反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)跌落，所以測(cè)抗體的血清標(biāo)本如需保存作多檢測(cè)，宜少量分裝冰存；使用一次性璵璃試管或真空管釆血管；并使用非抗凝標(biāo)本，肝素抗凝血漿會(huì)增加OD值，可能與高濃度肝素具有強(qiáng)大的負(fù)電荷能吸附酶標(biāo)記物不易洗脫有關(guān)；EDTA、酶抑制劑(如NaN3)可抑制ELsA系統(tǒng)中辣根過(guò)氧化物酶活性；血液標(biāo)本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，或標(biāo)本采集時(shí)用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽?/div>
二、試劑的影響
ELISA試劑經(jīng)歷了從合成肽向基因工程抗原的過(guò)渡。由于歷史的原因，人們往往以反應(yīng)本底的好壞來(lái)衡量ELISA反應(yīng)試劑盒，因此有些廠家為了保持較好的本底采用了單片段基因工程抗原及合成肽包被，該類試劑盒的流行病學(xué)敏感度不夠，穩(wěn)定性也成問(wèn)題。也有廠家堅(jiān)持試劑盒高的流行病學(xué)敏感度科學(xué)地對(duì)待反應(yīng)結(jié)果。基因工程抗原較合成肽抗原有無(wú)可比擬的優(yōu)越性，就 HCV-
ELISA試劑盒來(lái)講，代產(chǎn)品為合成肽抗原，主要是HC∨特異性抗原決定簇的肽片段；第二代產(chǎn)品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是當(dāng)時(shí)的基因工程抗原不全，僅包括了HCV的核心區(qū)片段第三代產(chǎn)品基本上采用了基因工程抗原，而且這些抗原包括更多、更穩(wěn)定、純度更高的HCⅴ特異性抗原。第三代試劑的敏感度大大提高了。基因工程抗原與合成肽抗原的區(qū)別如下:
基因工程抗原是抗原基因在質(zhì)粒載體中原核或真核表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為表達(dá)系統(tǒng)。該類抗原與合成肽相比具有以下特點(diǎn)。
1.分子量大。合成肽采用化學(xué)方法制備，由于工藝的局限，合成數(shù)量有限，只能達(dá)到數(shù)百個(gè)氨基酸；而利用基因工程制備的抗原，分子量更大。
2.穩(wěn)定性好。包被的抗原的穩(wěn)定性可使試劑盒的效期得到保證，早期以合成肽為包被抗原的試劑盒期只有3-4個(gè)月，采用基因工程抗原后效期大大延長(zhǎng)了。
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